Descrierea completă a metodei de reacție în lanț a polimerazei

Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este crearea de copii multiple dintr-o secțiune scurtă a ADN-ului uman. O cantitate mică de material fiziologic este necesară pentru cercetare și obținerea rezultatelor: spută, sânge, lichid amniotic, saliva, urină etc.

Ce este o reacție în lanț a polimerazei?

Metoda PCR a fost dezvoltată de cercetătorul american Melison, care a câștigat Premiul Nobel în 1998 pentru dezvoltarea sa. Utilizat în mod activ:

• cu diagnosticul precoce de infecții, patologii oncologice;
• într-un examen medico-legal pentru studierea unei cantități extrem de mici de ADN;
• în medicina veterinară, biologie, genetica moleculară;
• pentru identificarea personală de ADN;
• pentru a confirma paternitatea;
• în ecologie, de exemplu, atunci când urmărim calitatea produsului, în antropologie.

Cui este prescris PCR?

Reacția în lanț a polimerazei în diagnosticul de patologii infecțioase este una dintre cele mai fiabile metode care oferă cea mai exactă și fiabilă analiză. De exemplu, fiabilitatea analizei privind chlamydia este aproape de 100%. Cel mai adesea, această măsură de diagnosticare este prescrisă pacienților care, în timpul testului, au dificultăți în identificarea unui anumit agent patogen.

Testele de laborator PCR folosesc:

1. Pentru a căuta organisme patogene care provoacă infecții ale tractului urinar și genital, este dificil să se identifice atunci când se aplică culturi sau metode de imunologie.
2. Pentru reanaliza HIV în stadiul inițial cu un rezultat pozitiv, dar discutabil al analizei inițiale, de exemplu, la nou-născuții din părinții infectați.
3. Pentru a stabili patologia oncologică într-un stadiu incipient și pentru corectarea individuală a regimului de tratament la pacienți.
4. Pentru detectarea precoce și tratamentul potențial al patologiilor ereditare. Deci, mulți dintre viitorii părinți testează pentru a afla dacă sunt purtători de boli genetice. La copii, această metodă determină probabilitatea expunerii la boli moștenite.

De asemenea, această tehnică este folosită:

• pentru detectarea patologiei fetale la începutul sarcinii;
• la pacienții înainte de operația de transplant de organe - necesară pentru a determina compatibilitatea țesuturilor
• pentru a detecta agenții patogeni periculoși din sângele donatorului;
• la nou-născuți pentru detectarea infecțiilor ascunse;
• pentru a evalua rezultatele tratamentului antiviral sau antimicrobian.

De ce treci prin această procedură?

Deoarece PCR este considerat a fi o metodă de diagnostic extrem de eficientă care dă rezultate aproape 100%, această procedură este utilizată:

1. Pentru a confirma sau a exclude diagnosticul.
2. Pentru o evaluare rapidă a eficacității tratamentului.
3. În multe cazuri, această metodă este considerată singura modalitate posibilă de a detecta evoluția patologiei, dacă alte tehnici virologice bacteriologice s-au dovedit a fi inutile.
4. Virușii care utilizează procedura PCR sunt detectați imediat după infectare și înainte de apariția simptomelor principale.
5. Detectarea precoce a microorganismelor va permite un tratament prompt.

În plus, analiza PCR va permite detectarea rapidă a unui număr mic de microorganisme în probe vii sau moarte. Prin urmare, această tehnică este utilizată pentru a căuta un organism patogen specific, de exemplu un bacil de tuberculi.

În plus, se utilizează analiza PCR:

• pentru a determina sensibilitatea ADN-ului la anumite tipuri de antibiotice, ceea ce va permite, cât mai curând posibil, începerea tratamentului;
• pentru a controla răspândirea epidemiilor;
• pentru a identifica și urmări noi tipuri de microbi, agenți patogeni.

Principalele tipuri de PCR

Metoda standard

Analiza PCR este efectuată pe baza dublării multiple a unui fragment ADN specific și a ARN utilizând enzimele de primă. Datorită acestui lucru, cercetătorul primește cantitatea necesară de material.

PCR în timp real

În acest tip de cercetare, procesul de identificare a unui fragment dat este început după trecerea fiecărui ciclu. Acest tip de cercetare permite obținerea de informații privind numărul de viruși și microorganisme din organism, adică efectuarea unei analize cantitative.

Modul de transcriere inversă din PCR

Această analiză este utilizată pentru a căuta ARN monocatenar pentru detectarea ulterioară a virusurilor a căror bază genetică este denumită ARN. De exemplu, acesta este virusul hepatitei C, imunodeficiența și așa mai departe. În realizarea acestui studiu, se utilizează o enzimă specială, datorită căreia este construit ADN-ul monocatenar. Sistemul restabilește apoi cel de-al doilea șir de ADN și efectuează procedura tradițională.

Indicații pentru

Procedura PCR este utilizată în clinicile de boli infecțioase, obstetrică, urologie, ginecologie și nefrologie, pediatrie și așa mai departe. Cele mai comune indicii pentru analiză sunt:

• pentru a determina riscul de a dezvolta anomalii genetice la un copil în prezența unor patologii ereditare;
• pentru a diagnostica ambii părinți atunci când planifică o sarcină sau când mama se află într-o situație dificilă în timp ce duce un copil;
• cu dificultăți de concepție pentru a identifica cauzele infertilității;
• în caz de suspiciune de infecții sexuale în stadiul acut sau cu risc de tranziție la stadiul cronic;
• pentru a detecta cauzele proceselor inflamatorii de origine necunoscută;
• cu sex ocazional neprotejat;
• pentru a determina sensibilitatea unui microorganism patogen la un medicament specific;
• suspectată infecție latentă pentru a detecta agenții patogeni fără simptome evidente;
• pentru a confirma recuperarea de la o boală, adică un diagnostic retrospectiv.

De asemenea, se utilizează PCR atunci când este necesar să se identifice cu precizie astfel de agenți patogeni ca: virusurile hepatitei, imunodeficiența umană, citomegalovirusul, virusul herpes simplex, virusul rubeolei, virusul papilloma.

Acolo, această metodă este folosită pentru a determina infecțiile: mononucleoza infecțioasă, encefalita transmisă de căpușe, candidoza, care este cauzată de ciuperci candida, infecții genitale și tuberculoză.

În cazul contraindicațiilor și a metodei sigure?

Deoarece această procedură se desfășoară fără a avea vreun impact asupra corpului și se folosește doar material biologic, care este folosit pentru cercetare, nu există contraindicații datorate absenței unui potențial pericol pentru organism. Dar, de exemplu, prelevarea probelor biomateriale ale canalului cervical al uterului nu se efectuează după o colposcopie. Frotiul de livrare, ștergări sunt permise numai 4-7 zile după terminarea menstruației și încetarea completă a descărcării.

Caracteristicile pregătirii pentru procedură

Ca probă pentru analiza PCR, în care se detectează ADN-ul unui agent patogen străin, se utilizează fie un fluid biologic sau un țesut biologic. Aportul substanței de testat are loc sub formă de probe de sânge dintr-o venă, o răzuire din cavitatea nazală, laringel, cervix, uretra. Înainte de procedura de diagnosticare, medicul trebuie să explice pacientului ce material va fi luat:

• în analiza infecțiilor herpetice, mononucleoza face o analiză a urinei, precum și un frotiu din faringe;
• atunci când se testează pentru hepatită sau toxoplasmoză, sângele este luat dintr-o venă;
• în scopul diagnosticării diferitelor tipuri de leziuni ale SNC, se ia lichidul cefalorahidian;
• în pulmonologie, probe pentru analiza PCR sunt lichid pleural și spută;
• dacă efectuează un studiu al infecțiilor intrauterine în timpul sarcinii, se utilizează pentru analiză lichidul amniotic, celulele placentare.

Fiabilitatea și acuratețea rezultatului depind de sterilitatea și condițiile de luare a biomaterialului. Deoarece studiile PCR sunt extrem de sensibile, orice contaminare a substanței luate poate distorsiona rezultatele. Pregătirea adecvată pentru livrarea biomaterialului nu prezintă dificultăți pentru pacient.

Dar există o serie de recomandări:

• atunci când se analizează infecțiile cu transmitere sexuală, este necesar să se excludă contactele intime cu trei zile înainte de livrarea materialului;
• 72 de ore ar trebui să înceteze utilizarea oricăror preparate vaginale;
• din seara zilei precedente, nu se poate face o igienă a zonelor studiate
• Cu 3-4 ore înainte de a lua o mostră din uretra, urinarea ar trebui exclusă;
• cu o lună înainte de a lua testele, trebuie să întrerupeți administrarea de antibiotice;
• sângele este administrat dimineața pe un stomac gol înainte de a mânca și de a bea;
• Urina de dimineață este colectată într-un recipient steril după ce a fost dus la toaletă.

Cum este PCR?

La efectuarea cercetărilor într-un reactor special, se repetă un anumit ciclu:

1. Primul pas. Denaturarea. Saliva, sângele, testele ginecologice și alte substanțe sunt plasate în aplicator, unde materialul este încălzit și ADN-ul este împărțit în două lanțuri.
2. Al doilea pas. Răcirea ușoară a substanței preluate, adăugând componente speciale care recunosc părțile necesare ale moleculei DTC și se leagă de aceasta.
3. 3 pas. Alungirea. În timpul procesului, se finalizează un fragment al codului de eroare al organismului patogen, se formează o copie a acestuia. Acest ciclu se repetă, ceea ce dublează copia fragmentului specific de ADN.

În câteva ore, se formează multe copii ale acestui fragment, prezența lor în eșantioane fiind dezvăluită. Apoi, rezultatele sunt comparate cu bazele de date ale diferitelor tipuri de agenți patogeni. Acest lucru vă permite să determinați tipul de infecție.

Caracteristicile analizei de decodare?

Rezultatul final al studiului va fi dat pacientului la câteva zile după analiza biologică.

Analiza calitativă

Un rezultat negativ în acest caz înseamnă că nu a fost detectat niciun agent infecțios în lichidul care a fost supus testării. Un rezultat pozitiv indică detectarea virusurilor sau a bacteriilor patogene într-o probă biologică. Dacă rezultatul a fost pozitiv, dar în același timp persoana nu are semne de activare a infecției, o astfel de afecțiune a corpului se numește purtătoare asimptomatică sănătoasă.

Cel mai adesea, acest lucru se observă atunci când se ia biomaterialul în patologiile virale. În acest caz, tratamentul nu este necesar, dar necesită o supraveghere medicală constantă. Întrucât în ​​astfel de condiții există o probabilitate:

• răspândirea virusului de la transportator la oameni sănătoși;
• activarea procesului și tranziția patologiei la forma cronică.

Analiza cantitativă

Rezultatul cantitativ este determinat de un specialist special pentru un anumit tip de infecție. Pe baza rezultatelor obținute, este posibil să se evalueze gradul de dezvoltare, stadiul patologiei, ceea ce face posibilă prescrierea tratamentului cât mai repede posibil.